Mit Hilfe der mikroskopischen und kulturellen mykologischen Diagnostik läßt sich nachweisen, ob ein bestimmtes klinisches Bild eine Mykose ist. Aus der Art des Erregers ergeben sich letztlich Informationen über mögliche Infektionsquellen und die Wirksamkeit verschiedener Medikamente.
Die fachgerechte Entnahme von Material für mykologische Untersuchungen ist von besonders großer Bedeutung, da eine unmittelbare Auswirkung auf die Qualität der Befundung besteht. Aus diesem Grund werden anschließend die verschiedenen Techniken zur Gewinnung von Untersuchungsmaterial ausführlich beschrieben.
Nachweismethoden von Sproßpilzen und Dermatophyten
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MaterialgewinnungDie Entnahmetechnik von Untersuchungsmaterial ist abhängig von der betroffenen Lokalisation. Vor Beginn der Materialgewinnung - von Haut, Haar oder Nagel - ist eine gründliche mechanische und chemische Reinigung der Entnahmestelle mittels Klinge, Mulltupfern und 70%igem Alkohol empfohlen. Von der Verwendung von Wattetupfern muß abgeraten werden, da die sehr dünnen Fasern die mikroskopische Begutachtung erschweren. Von besonderer Bedeutung ist die Reinigung der erkrankten Körperstellen, wenn zuvor eine Behandlung mit Cremen, Salben, Pudern oder diversen Kosmetika erfolgte.
Allfällige topische Medikationen sollten mindestens 14 Tage zurückliegen, um ein falsch-negatives mykologisches Resultat weitgehendst auszuschließen. Werden Schleimhaut-Abstriche für den Nachweis von Pilzen durchgeführt, ist eine vorherige Reinigung der Abnahmestelle nicht von Nöten. 1. Hautschuppen und Haare
Die Entnahme von Untersuchungsmaterial soll grundsätzlich mit einer sterilen Skalpellklinge oder einem scharfen Löffel vom Rand der Läsionen auf der Haut erfolgen, da an diesen Stellen im allgemeinen aktives Pilzwachstum auftritt. Im Falle einer fraglichen Tinea capitis sollen zusätzlich auch einige Haare vom Rand der Läsion ausgerissen und beigefügt werden. Hautschuppen und Haarstümpfe können in sterilen Schalen, Versandkuverts oder auf Objektträger gesammelt werden. 2. Nägel
Die Nagelproben entnimmt man dem verfärbten, verdickten und zerbröckelnden Anteil des Nagels. Da die vitalsten Pilzelemente im proximalen Anteil des infizierten Nagels vorliegen, ist die Probengewinnung unter möglichst weitem Eindringen des Skalpells von der Unterseite des Nagels vorzunehmen. Ist dies nicht durchführbar, sollte der Nagel distal abgeschnitten werden und das verdächtige subunguale Gewebe anschließend mit einer sterilen Klinge abgeschabt werden. Zum Auffangen der Schuppen eignen sich sterile Petrischalen, Objektträger oder Versandkuverts. 3. Proben aus dem Urogenital- und Oropharyngealbereich
An den Schleimhäuten kann das Material mit einem sterilen, mit physiologischer Kochsalzlösung befeuchteten Watteträger gewonnen werden. Weiters besteht die Möglichkeit einen Abklatsch, d. h. direktes Aufbringen der erkrankten Körperregion auf einen geeigneten Nährboden, herzustellen (z. B. Glans). 4. Sputum
Da das Sputum leicht Verunreinigungen ausgesetzt ist, muß die Mundhöhle vor Erbringung des Untersuchungsmaterials sorgfältig gereinigt werden. Weiters ist es zweckmäßig, die Untersuchung mehrfach an aufeinanderfolgenden Tagen durchzuführen. Das Sputum wird in einem sterilen Becher gesammelt und sofort mikroskopiert und/oder auf geeignete Nährböden aufgebracht. 5. Faeces
In einem sterilen Gefäß wird eine kleine (nußgroße) Stuhlprobe gesammelt - vorzugsweise von verschiedenen Stellen einer Stuhlportion. Die Verarbeitung des Materials sollte so schnell als möglich stattfinden, da durch lange Verzögerung die festzustellende Keimzahl verfälscht werden könnte. 6. Urin
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Einige Milliliter Mittelstrahlharn werden in einem sterilen Becher aufgefangen. Eine Verarbeitung des Materials zu einem Nativpräparat sowie einer Kultur sollte schnellstmöglich erfolgen, um eine genaue Keimzahlbestimmung zu gewährleisten. |
Direktnachweis im NativpräparatAnlegen eines Nativ- oder KOH-Präparates
Auf einem Objektträger wird reichlich Untersuchungsmaterial (Hautschuppen, Haare, feine Nagelspäne) ausgebreitet, mit 10 - 30%-iger Kalilauge benetzt und mit einem Deckglas bedeckt. Anschließend wird die Probe leicht erwärmt (über einer Flamme) oder 10 - 30 Minuten bei Raumtemperatur aufgehellt. Danach erfolgt die Durchmusterung des Präparats bei 100-facher, sowie die Bestätigung von Pilzelementen bei 400-facher Vergrößerung. Wurde Sekret aus dem Urogenitaltrakt oder Oropharyngealbereich mit einem Watteträger oder einer Öse entnommen, kann das Material durch leichtes Ausdrücken des Tupfers - unter Drehbewegung - auf einen Objektträger gebracht, 1- 2 Tropfen Kalilauge oder physiologischer Kochsalzlösung zugesetzt und ein Deckglas aufgelegt werden. Das Präparat kann daraufhin sofort untersucht werden. Abb. 1 - 4 Auswertung des Nativpräparats
Der Nachweis von Hyphen, Pseudohyphen oder Sproßzellen im Nativ beweist lediglich, daß sich im Untersuchungsmaterial Pilzelemente befinden. In den meisten Fällen ist eine Gattungs- oder Artdiagnose nicht möglich. Weiters kann nicht beurteilt werden, ob es sich um bereits abgetötetes, abgestorbenes oder vitales Material handelt. Diese Frage kann nur mittels Kultur beantwortet werden. Werden keine Pilzelemente entdeckt, d. h. das Nativpräparat ist negativ, kann die Kultur trotzdem positiv sein. Diese Möglichkeit besteht, wenn zufällig keine oder nur geringe Mengen an Pilzelementen im Präparat vorhanden waren (z. B. nach antimykotischer Therapie). Färbungstechniken
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Als gängigste Färbeverfahren in der Untersuchung von Nativpräparaten gelten die Methylenblaufärbung und die Färbung mit Parker-Tinte. Seltener werden Pilzelement mit Hilfe von Fluoreszenzfarbstoffen sichtbar gemacht. Weitere Techniken zur Darstellung und Erkennung von Sproßzellen und/oder Hyphen in fixierten Präparaten sind die Giemsa- und Gramfärbung, die Pilzelemente blauviolett erscheinen lassen, sowie die Perjodsäure-Schiff-Färbung oder die Methenamin-Silbernitrat-Färbung. Die Schleimkapsel von Cryptococcus neoformans kann mit dem Tuscheverfahren nach Burri dargestellt werden (Abb. 5). Die Lactophenolblaufärbung (Abb.6) eignet sich in erster Linie für die Identifizierung von Dermatophyten und Schimmelpilzen, da sich Mikro- und Makrokonidien ebenso wie Sporen bestens anfärben. |
PilzkulturUm Pilze zu züchten, steht eine Vielzahl verschiedener Nährböden - in Petrischalen oder als Schrägagar-Röhrchen - und Nährlösungen zu Verfügung. Die Verwendung von Standardnährböden erleichtert die Identifizierung unterschiedlicher Pilze, da die charakteristischen Wuchsformen sowie die Bildung von sexuellen und asexuellen Fruchtkörpern beobachtet werden können.
Die größte Gefahr bei der Anzucht von Pilzen besteht in einer Verunreinigung mit Schimmelpilzen, die durch ihr rasches Wachstum die Labordiagnostik erheblich beeinträchtigen können. Aus diesem Grund werden in den meisten Fällen zumindest zwei verschiedene Nährböden - mit und ohne schimmelhemmendem Cycloheximid - zur Kultivierung verwendet. Einige der unten angeführten Nährmedien ermöglichen das Wachstum fast aller Pilze (¦), andere hingegen dienen zur Isolierung und/oder Identifizierung bestimmter Gruppen von Pilzen ( ). Standardnährmedien für Pilzkulturen
- Sabouraud-Dextrose/Maltose-Agar (¦) - Sabouraud-Dextrose-Bouillon (¦) - Kimmig-Agar (¦) - Kartoffel-Dextrose-Agar (¦) - Selektivagar für pathogene Pilze (¦) - Chromagar Candida ( ) - Reisagar ( ) - Maismehlagar ( ) - Nickerson-Agar ( ) Anlegen einer Pilzkultur
Die Beimpfung muß unter sterilen Bedingungen erfolgen. Dafür wird etwas Untersuchungsmaterial (Haare, Haut- oder Nagelschüppchen, Abstrich) mit einer Öse oder einem Tupfer in die Mitte der Nährboden-Platte/ Schrägagar-Rörchens gebracht und 2 - 3 Wochen bei Raumtemperatur inkubiert. Werden Flüssigkulturen angelegt, erfolgt die Bebrütung in der Regel bei 37°C für 2 - 3 Tage. Anschließend erfolgt die Identifikation mittels Überimpfen auf dafür geeignete Medien, erneute Bebrütung und Mikroskopie der Kultur. Die Wahl der Abnahmetechnik, des Nährmediums und der Bebrütung ist abhängig von der Lokalisation des Krankheitsherdes sowie von der klinischen Verdachtsdiagnose. Identifizierung medizinisch wichtiger Pilze
Nach dem DHS-System werden human- und tierpathogenen Pilze in Dermatophyten, Hefen sowie Schimmelpilzen und sonstigen Pilzen unterschieden. Eine Sonderstellung nehmen in diesem System die 'dimorphen Pilze' - durchwegs pathogene Organismen - ein. Auf jede der einzelnen Gruppen soll nun in Kürze eingegangen, sowie die Kriterien, die zur Identifizierung der Gattungen oder Spezies führen, erwähnt werden. 1. Dermatophyten
Die Dermatophyten - im engeren Sinne - unterscheidet man nach den asexuellen Fruchtformen (Konidien), und zwar in die drei Gattungen: - Trichophyton (Abb. 7 - 13) - Microsporum (Abb. 14, 15) - Epidermophyton (Abb. 16) Die Gattung Keratinomyces wird von den meisten Autoren in die Gattung Trichophyton eingeordnet. Charakteristisch für Dermatophyten sind Mikro- und Makrokonidien, die zur Gattungs- und Artbestimmung verwendet werden. Da in manchen Fällen keine Makrokonidien gebildet werden, dient insbesondere das Aussehen der Kultur auf verschiedenen Nährböden als Unterscheidungsmerkmal für eine Identifizierung. Werden Sexualsporen (Askosporen) ausgebildet spricht man von den perfekten teleomorphen Formen, die für einige Trichophyton- und Microsporum-Arten bekannt sind. Diese Formen werden der Gattung Arthroderma zugeordnet. Zusammenfassung der wichtigsten mikroskopischen Unterscheidungsmerkmale der häufigsten Dermatophyten-Gattungen in der Praxis:
2. Hefen
Hefepilze sind Einzeller, die sich durch Sprossung vermehren. Bleiben diese Sproßzellen (Blastosporen) miteinander verbunden, spricht man von einem Pseudomyzel, das durch Ausbildung von Querwänden (Septen) im Inneren zu einem echten Myzel werden kann. Die Einteilung der Hefen erfolgt nach den vorhandenen Sexualorganen. Die Sexualsporen (Askosporen oder Basidiosporen) bildenden Hefen werden auch perfekte Hefen (Ascomycotina und Basidiomycotina) genannt, während die imperfekten Hefen (Deuteromycotina) ausschließlich asexuelle Sporen bilden. Unterscheidungsmerkmale sind unter anderem die Bildung von Pigmenten, Arthrosporen, Chlamydosporen, Pseudomyzel oder echtem Myzel, die Art der Sprossung oder die Zellform. Als weitere Identifizierungshilfen stehen kommerziell erhältliche Kitts (API-Systeme) zur Verfügung, die eine Speziesbestimmung mittels biochemischer Leistungen (d. s. Stickstoff- und Zucker-Assimilation sowie Zucker-Fermentation) der zu untersuchenden Art ermöglichen. Die Bestimmung der Hefen nach Gattung und Art erfolgt demnach aufgrund ihrer morphologischen und physiologischen Eigenschaften. Am besten werden die mikromorphologischen Merkmale auf Reisextrakt- oder Maismehlagar studiert. Hierfür wird eine Agar-Platte mit wenig Hefematerial in Schlangenlinien beimpft, mit einem Deckglas bedeckt und 24 - 48 Stunden bei 20 - 25 °C bebrütet. Danach kann im Mikroskop die Ausbildung von Blastosporen, Pseudomyzel und echtem Myzel sowie von Chlamydosporen beobachtet werden. Bei den klinisch relevanten Hefepilzen handelt es sich im wesentlichen um imperfekte Hefen der Gattungen:
Die wesentlichen Gattungs- und Artenmerkmale von Hefen und verwandten Pilzen werden in Tab.1. und 2. sowie in Abb.7 ausführlich dargestellt. 3. Schimmelpilze
Im Vergleich zu Dermatophyten charakterisieren sich Schimmelpilze durch rasches Wachstum von Kolonien mit massiver Bildung asexueller Sporen. Es handelt sich jedoch nicht um eine systematisch abgegrenzte und exakt definierte Pilzgruppe. Als wesentliches Merkmal zur Differenzierung zwischen Schimmelpilzen und Dermatophyten sowie zur Artbestimmung dienen die meist reichlich vorhandenen Fruchtkörper. Medizinisch bedeutsam sind Vertreter der Gattungen Mucor, Rhizopus und Rhizomucor als Erreger von Mucormykosen, Aspergillus-Arten (Abb. 24) als Verursacher von Aspergillosen, Scopulariopsis brevicaulis bei Nagelmykosen (Abb. 25) und andere Schimmelpilze als Inhalationsallergene und Mykotoxinbildner (z. B. Penicillium Abb.27, Fusarium). Genauere Angaben zu den wichtigsten Vertreter der Dermatophyten- und Schimmelpilz-Gattungen, sowie Sproßpilz-Arten insbesondere aber zum Erscheinungsbild der Kulturen, sowie der vegetativen und reproduktiven Organe sind aus den Farbtafeln ersichtlich. Abb. 26: S. brevicaulis Deckglaskultur, > Lactophenolblau gefärbt 4. Dimorphe Pilzgruppe
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Die 'dimorphen oder biphasischen Pilze' entwickeln zwei morphologisch unterschiedliche (eine Hefe- und eine Myzel-Form) Phasen. Dieser Dimorphismus kann einerseits temperaturabhängig sein, wie z. B. bei Blastomyces dermatitidis, Histoplasma capsulatum spp. oder Sporothrix schenckii, oder als Gewebsdimorphismus ausgebildet werden, wie er bei Coccidioides immitis beobachtet werden kann. Es handelt sich bei dieser Pilzgruppe um Erreger von Systemmykosen, die ihren Ursprung zumeist in Infektionen der Lunge haben. Die Diagnostik beruht sowohl auf dem direkten Nachweis der parasitären Hefe-Form mittels Mikroskopie als auch auf der Kultivierung von Hefe- und Myzel-Form auf verschiedenen Nährböden. |